Température de fusion et hybridation
En PCR, de courtes amorces d’ADN simple brin doivent s’hybrider sur la matrice lors de l’étape d’hybridation. La température de fusion (Tm) est la température à laquelle la moitié des amorces sont appariées à leur cible. La température d’hybridation (Ta) est en général fixée quelques degrés sous la Tm de l’amorce la plus basse : trop basse, les amorces se fixent au mauvais endroit ; trop haute, elles se fixent à peine.
Les formules utilisées
Règle de Wallace, pour les oligonucléotides courts jusqu’à 14 bases environ :
Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)
Formule corrigée du sel, pour les amorces plus longues :
Tm = 81,5 + 16,6 × log10[Na⁺] + 0,41 × %GC − 600 ÷ longueur
avec [Na⁺] en mol/L. Les paires G–C ont trois liaisons hydrogène et un empilement plus stable que les paires A–T : les amorces riches en GC fondent à plus haute température. Une concentration en sel plus forte stabilise le duplex et augmente aussi la Tm.
Exemple
Une amorce sens de 20 bases contenant 10 G ou C (50 % de GC) et une amorce antisens de 22 bases avec 11 G ou C, dans 50 mM de sel :
- Tm sens ≈ 50,4 °C, Tm antisens ≈ 53,1 °C ;
- Ta de départ suggérée ≈ 50,4 − 5 ≈ 45 °C.
Une réserve importante
Ces formules simples ignorent l’ordre réel des bases, la concentration en amorces et le magnésium. Les méthodes des plus proches voisins (nearest-neighbor), utilisées par les outils en ligne des fournisseurs de polymérases, donnent en général des Tm plus élevées de plusieurs degrés pour des amorces courantes, et certaines polymérases haute fidélité ont leurs propres règles. Servez-vous de ce calculateur comme première estimation, puis suivez les consignes de votre polymérase.
Règles de conception des amorces
- Longueur de 18 à 25 bases.
- Teneur en GC de 40 à 60 %.
- Tm des deux amorces à moins de 5 °C l’une de l’autre.
- Un G ou un C à l’extrémité 3′ (« GC clamp »), mais pas plus de 3 G ou C dans les 5 dernières bases.
- Évitez les répétitions de 4 bases identiques ou plus, les structures en épingle à cheveux et la complémentarité entre amorces, source de dimères.
Optimiser la température d’hybridation
- Faites une PCR en gradient sur environ 8 °C autour de la Ta estimée, et retenez la température qui donne une bande unique et intense.
- Augmentez la Ta si vous voyez des bandes parasites ou une traînée ; diminuez-la s’il n’y a pas de produit.
- La PCR touchdown démarre au-dessus de la Tm et baisse la Ta de 0,5 à 1 °C par cycle, ce qui favorise une hybridation spécifique au début.