Doser les acides nucléiques par absorbance
L’ADN et l’ARN absorbent fortement les ultraviolets à 260 nm, en raison des cycles de leurs bases azotées. Un spectrophotomètre, à cuve ou à microvolume, mesure cette absorbance (A260) et la convertit en concentration. Les mesures à 280 et 230 nm révèlent ensuite la présence de protéines, de sels ou de solvants dans l’échantillon.
Les formules
- Concentration (ng/µL, équivalent à µg/mL) = A260 × facteur de conversion × facteur de dilution
- Facteurs pour un trajet optique de 1 cm : 50 pour l’ADN double brin, 40 pour l’ARN, environ 33 pour l’ADN simple brin et les oligonucléotides
- Quantité totale (µg) = concentration × volume (µL) ÷ 1 000
- Copies par µL = concentration (ng/µL) × 6,022 × 10²³ ÷ (longueur × 650 g/mol par paire de bases × 10⁹) pour l’ADN double brin
Exemple chiffré
Une préparation de plasmide est diluée au 1/10 et donne A260 = 0,75, A280 = 0,40 et A230 = 0,36. Le volume total est de 50 µL.
- Concentration : 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL.
- Quantité totale : 375 × 50 ÷ 1 000 = 18,75 µg.
- A260/A280 = 0,75 ÷ 0,40 = 1,88 : bonne pureté pour de l’ADN.
- A260/A230 = 0,75 ÷ 0,36 = 2,08 : pas de trace de sels.
Si le plasmide fait 5 000 pb, cela représente environ 6,9 × 10¹⁰ copies par µL.
Lire les rapports de pureté
| Rapport | Valeur attendue | Une valeur basse suggère |
|---|---|---|
| A260/A280, ADN | environ 1,8 | Protéines ou phénol |
| A260/A280, ARN | environ 2,0 | Protéines ou phénol |
| A260/A230 | 2,0 à 2,2 | Sels de guanidine, EDTA, phénol, glucides |
Une préparation d’ADN avec un A260/A280 nettement supérieur à 2,0 peut contenir de l’ARN : un traitement à la RNase suivi d’une nouvelle purification règle le problème.
Des mesures fiables
- Restez dans la zone linéaire : sur un spectrophotomètre à cuve, les absorbances entre 0,1 et 1,0 environ sont les plus fiables. Diluez les échantillons trop concentrés.
- Faites le blanc avec le tampon de l’échantillon, TE ou tampon d’élution.
- Homogénéisez bien : l’ADN génomique est visqueux et peut donner des mesures irrégulières.
- Le pH influence le rapport 260/280 : une eau légèrement acide le fait baisser. Un tampon légèrement basique donne des valeurs plus stables.
- L’absorbance ne distingue pas l’ADN de l’ARN ni des nucléotides libres. Pour les faibles concentrations ou les mélanges, un dosage par fluorescence est plus spécifique.