Pourquoi diluer en cascade
Les cultures bactériennes, les suspensions de virus ou de cellules sont souvent bien trop concentrées pour être dénombrées directement : une culture peut contenir un milliard de cellules par millilitre. Une dilution unique au millionième demanderait un prélèvement minuscule. La dilution en série y parvient par étapes, en général au dixième, avec des volumes de pipette ordinaires et une bien meilleure précision.
Les formules
- Facteur de dilution par étape = (volume prélevé + volume de diluant) ÷ volume prélevé
- Dilution totale = facteur par étape ^ nombre d’étapes
- Concentration finale = concentration de départ ÷ dilution totale
- Colonies attendues = concentration finale × volume étalé
- Calcul inverse : UFC/mL = colonies ÷ (volume étalé en mL × dilution totale)
Exemple chiffré
Une culture bactérienne contient environ 10⁸ UFC/mL. Vous transférez 100 µL dans 900 µL de diluant stérile, cinq fois de suite, puis vous étalez 100 µL du dernier tube.
- Facteur par étape : (100 + 900) ÷ 100 = 10.
- Dilution totale après 5 étapes : 10⁵ = 100 000.
- Concentration finale : 10⁸ ÷ 10⁵ = 1 000 UFC/mL.
- Colonies attendues : 1 000 × 0,1 mL = 100, dans la zone de comptage.
- Diluant nécessaire : 5 × 900 µL = 4,5 mL.
Concentration à chaque étape
| Tube | Dilution totale | Concentration (à partir de 10⁸/mL) | Colonies pour 100 µL |
|---|---|---|---|
| 1 | 10⁻¹ | 10⁷ | trop nombreuses |
| 2 | 10⁻² | 10⁶ | trop nombreuses |
| 3 | 10⁻³ | 10⁵ | trop nombreuses |
| 4 | 10⁻⁴ | 10⁴ | 1 000, trop nombreuses |
| 5 | 10⁻⁵ | 10³ | 100, dénombrables |
| 6 | 10⁻⁶ | 10² | 10, trop peu |
En étalant deux ou trois dilutions successives, on obtient au moins une boîte entre 30 et 300 colonies.
Autres gammes courantes
- Au demi, 500 µL dans 500 µL : pour les CMI d’antibiotiques et les gammes étalons.
- Au cinquième, 200 µL dans 800 µL.
- Au centième, 10 µL dans 990 µL : moins de tubes, mais une erreur de pipetage plus grande.
Pour plus de précision
- Changez de cône à chaque étape : un reste du tube précédent, plus concentré, fausse le suivant.
- Homogénéisez soigneusement avant chaque prélèvement, au vortex ou par aspirations successives.
- Les erreurs se cumulent : 2 % d’erreur de pipetage par étape deviennent environ 10 % après cinq étapes.
- Ensemencez en double et faites la moyenne des comptages.