Medir ADN con el espectrofotómetro
Después de una extracción de ADN o ARN, lo primero es saber cuánto material tienes y si está limpio. Los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta con un máximo a 260 nm, así que basta una lectura en un espectrofotómetro o en un equipo de microvolumen para estimar la concentración. Las lecturas a 280 y 230 nm sirven para detectar contaminantes.
Las fórmulas
Concentración (ng/µL) = A260 × factor × dilución
El factor vale 50 µg/mL para el ADN de doble cadena, 40 para el ARN y unos 33 para el ADN monocatenario. Como 1 µg/mL equivale a 1 ng/µL, el resultado sale directamente en ng/µL.
Cantidad total (µg) = concentración × volumen (µL) ÷ 1000
Copias por µL = concentración × 6,022 × 10²³ ÷ (longitud × masa media por base × 10⁹)
Se toman 650 g/mol por par de bases de ADN, 340 por base de ARN y 330 por base de ADN monocatenario.
Ejemplo resuelto
Diluyes 5 µL de tu ADN plasmídico en 45 µL de agua (dilución 1:10) y lees una A260 de 0,75, una A280 de 0,40 y una A230 de 0,36. La concentración es 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL. En los 50 µL de la muestra tienes 18,75 µg. La relación A260/A280 vale 1,88 y la A260/A230, 2,08: una preparación limpia. Si el plásmido mide 5000 pb, hay unos 69.500 millones de copias por microlitro.
Cómo interpretar las relaciones de pureza
- A260/A280 cerca de 1,8 para el ADN y de 2,0 para el ARN: buena pureza.
- A260/A280 bastante por debajo de 1,8: proteínas o fenol. Repite la limpieza o una precipitación.
- A260/A230 por debajo de 1,8: sales caotrópicas de los kits de columna, EDTA, fenol o glúcidos. Un lavado extra con etanol suele mejorarla.
- A260/A280 por encima de 2 en un ADN: posible ARN contaminante. Un tratamiento con ARNasa lo resuelve.
Consejos para una lectura fiable
Trabaja dentro del rango lineal del aparato, en general con una A260 entre 0,1 y 1; si la muestra está muy concentrada, dilúyela. Haz el blanco con el mismo tampón en el que está disuelto el ácido nucleico, porque el TE y algunos tampones de elución absorben algo a 230 nm. Mezcla bien la muestra antes de medir, sobre todo el ADN genómico, que es viscoso. Para cuantificar con precisión cantidades muy pequeñas, o para PCR cuantitativa y secuenciación, un método fluorimétrico con colorantes específicos del ADN de doble cadena es más exacto que la absorbancia.