Diluir por pasos
Cuando una muestra es demasiado concentrada para medirla o contarla, como un cultivo bacteriano con cien millones de células por mililitro, no se puede diluir de golpe: haría falta un volumen enorme de diluyente. La solución es diluir en cascada, pasando una pequeña parte de cada tubo al siguiente. Con cinco pasos 1:10 se consigue una dilución de cien mil veces usando solo unos mililitros.
Las fórmulas
Factor por paso = (volumen pasado + volumen de diluyente) ÷ volumen pasado
Factor total = factor por paso ^ número de pasos
Concentración final = concentración inicial ÷ factor total
Colonias esperadas = concentración final × volumen sembrado
Ejemplo resuelto
Partes de un cultivo de unos 10⁸ UFC/mL. Pasas 100 µL a 900 µL de suero fisiológico estéril: cada paso diluye 10 veces. Tras cinco pasos, el factor total es 10⁵ y el último tubo contiene unas 1000 UFC/mL. Si siembras 100 µL en una placa, esperas unas 100 colonias, dentro del rango contable. Con un sexto paso solo verías unas 10, demasiado pocas para un recuento fiable. Necesitas 4,5 mL de diluyente en total.
El rango contable
Las placas se cuentan cuando tienen entre 30 y 300 colonias:
- Más de 300: las colonias se tocan y se fusionan, y el recuento se subestima.
- Menos de 30: el azar pesa demasiado y el error relativo es grande.
Por eso se siembran varias diluciones consecutivas y se cuenta la que cae en el rango.
Cómo calcular las UFC/mL de la muestra
UFC/mL = colonias ÷ (volumen sembrado en mL × dilución del tubo)
Si cuentas 87 colonias en una placa sembrada con 0,1 mL del tubo 10⁻⁵, la muestra original tenía 87 ÷ (0,1 × 10⁻⁵) = 8,7 × 10⁷ UFC/mL.
Buenas prácticas
- Prepara y rotula todos los tubos con el diluyente antes de empezar.
- Cambia de punta en cada paso para no arrastrar líquido del tubo anterior.
- Mezcla bien cada tubo, con vórtex o pipeteando varias veces, antes de pasar al siguiente.
- Trabaja en condiciones estériles, cerca del mechero o en cabina.
- Siembra por duplicado o triplicado para promediar.
Otros usos
Las diluciones seriadas se usan también en serología para hallar el título de anticuerpos, en curvas de calibrado para ELISA o PCR cuantitativa y en farmacología para preparar gamas de concentraciones. Los pasos 1:2 se usan cuando se necesita más resolución, y los 1:10 cuando hay que cubrir muchos órdenes de magnitud.