Mesurer une concentration avec la lumière
Quand la lumière traverse une solution colorée, une partie est absorbée, d’autant plus que les espèces absorbantes sont nombreuses. La loi de Beer-Lambert traduit cette idée par une relation de proportionnalité entre l’absorbance et la concentration. Elle est au cœur de la spectrophotométrie UV-visible, au programme de première et de terminale, et de nombreuses analyses médicales et environnementales.
Les formules
- Absorbance A = ε × l × c
- Concentration c = A ÷ (ε × l)
- Transmittance T = 10^(−A), soit A = −log T
ε est le coefficient d’absorption molaire (L·mol⁻¹·cm⁻¹), propre à l’espèce et à la longueur d’onde, l la longueur de la cuve en cm et c la concentration en mol/L. Au lycée, on écrit souvent simplement A = k × c, avec k = ε × l.
Exemple chiffré
Le NADH absorbe fortement à 340 nm avec ε = 6 220 L·mol⁻¹·cm⁻¹. Dans une cuve de 1 cm, un échantillon donne A = 0,500.
- c = 0,500 ÷ (6 220 × 1) = 8,04 × 10⁻⁵ mol/L = 80,4 µmol/L.
- Transmittance = 10^(−0,5) = 31,6 % de la lumière traverse l’échantillon.
Cette mesure sert de base à de nombreux dosages enzymatiques en biochimie, qui suivent l’apparition ou la disparition du NADH.
Absorbance et transmittance
| Absorbance | Lumière transmise |
|---|---|
| 0 | 100 % |
| 0,1 | 79 % |
| 0,5 | 32 % |
| 1 | 10 % |
| 2 | 1 % |
| 3 | 0,1 % |
La courbe d’étalonnage
En travaux pratiques, on ne connaît généralement pas ε. On prépare une gamme de solutions étalons par dilution d’une solution mère, on mesure leur absorbance à la longueur d’onde du maximum d’absorption, puis on trace A en fonction de c. Si les points sont alignés sur une droite passant par l’origine, la loi est vérifiée, et l’absorbance de la solution inconnue donne sa concentration par lecture graphique. Le coefficient directeur de la droite vaut ε × l.
Choisir la longueur d’onde
On se place au maximum d’absorption de l’espèce, repéré sur son spectre : c’est là que la mesure est la plus sensible et la moins affectée par un petit décalage de réglage. Pour une solution de permanganate de potassium, violette, le maximum se situe vers 525 nm, dans le vert, couleur complémentaire du violet.
Rester dans le domaine de linéarité
La plupart des appareils sont fiables entre 0,1 et 1,0 d’absorbance, parfois jusqu’à 1,5. Au-delà, trop peu de lumière atteint le détecteur ; en dessous, le signal est faible. Si la mesure est trop élevée, diluez l’échantillon et multipliez le résultat par le facteur de dilution. Faites toujours le blanc avec le solvant seul.
Quand la loi n’est plus valable
Des écarts apparaissent pour les solutions concentrées, quand les espèces s’associent ou réagissent entre elles, pour les solutions troubles qui diffusent la lumière, et quand la lumière n’est pas monochromatique.