Medir concentraciones con luz
Una disolución coloreada absorbe parte de la luz que la atraviesa, y cuanto más concentrada está, más absorbe. La ley de Beer-Lambert convierte esta observación en una relación cuantitativa y es la base de la espectrofotometría, una de las técnicas más usadas en laboratorios de análisis clínicos, de aguas, de alimentos y de bioquímica.
La ley
A = ε × l × c
- A: absorbancia, sin unidades.
- ε: coeficiente de absorción molar, en L·mol⁻¹·cm⁻¹, propio de cada sustancia y longitud de onda.
- l: paso óptico, la anchura de la cubeta, normalmente 1 cm.
- c: concentración en mol/L.
La absorbancia se relaciona con la transmitancia T, la fracción de luz que atraviesa la muestra:
A = −log T, o T = 10^(−A)
Ejemplo resuelto
El NADH absorbe a 340 nm con ε = 6220 L·mol⁻¹·cm⁻¹. Una muestra en una cubeta de 1 cm da A = 0,5:
- c = 0,5 ÷ (6220 × 1) = 8,04 × 10⁻⁵ mol/L = 80,4 µmol/L.
- Transmitancia: 10^(−0,5) = 31,6 %.
Esta medida es la base de muchos análisis enzimáticos de bioquímica clínica, como la determinación de la glucosa o de las transaminasas.
Absorbancia y transmitancia
| Absorbancia | Transmitancia |
|---|---|
| 0 | 100 % |
| 0,3 | 50 % |
| 1 | 10 % |
| 2 | 1 % |
| 3 | 0,1 % |
La zona fiable
La ley se cumple bien entre absorbancias de 0,1 y 1 a 1,5 aproximadamente. Por debajo, la señal es tan pequeña que el ruido del aparato pesa mucho; por encima, llega tan poca luz al detector que la medida pierde precisión y aparecen desviaciones de la linealidad. Si la absorbancia es muy alta, diluye la muestra y multiplica el resultado por el factor de dilución.
La recta de calibrado
En la práctica, en lugar de fiarse de un valor de ε tabulado, se preparan varias disoluciones patrón de concentración conocida, se mide su absorbancia y se traza una recta. La concentración de la muestra se lee en esa recta. Así se compensan las particularidades del aparato y del método.
Cuándo falla la ley
- Disoluciones muy concentradas, en las que las moléculas interactúan entre sí.
- Muestras turbias que dispersan la luz.
- Luz no monocromática o luz parásita en el aparato.
- Especies que cambian con la concentración o el pH, como los indicadores.
Consejos
- Mide a la longitud de onda del máximo de absorción, donde la sensibilidad es mayor.
- Haz siempre el blanco con el disolvente y la misma cubeta.
- Usa cubetas de cuarzo por debajo de unos 340 nm; el plástico y el vidrio absorben en el ultravioleta.