Pourquoi mesurer l’efficacité
En PCR quantitative, chaque cycle devrait idéalement doubler la quantité de cible. En réalité, l’efficacité est souvent un peu inférieure, parfois supérieure à cause d’inhibiteurs ou d’erreurs de pipetage. La connaître est indispensable pour comparer des échantillons, valider une paire d’amorces et choisir entre la méthode des ΔΔCt et une méthode corrigée.
La gamme étalon
On prépare une série de dilutions au dixième (ou au demi) d’un échantillon connu, on mesure le Ct de chacune, puis on trace le Ct en fonction du log10 de la quantité. La droite de régression a une pente négative.
Efficacité = 10^(−1 ÷ pente) − 1
Le facteur d’amplification par cycle vaut 1 + efficacité : 2 pour une efficacité parfaite de 100 %.
Exemple
Une pente de −3,4 donne 10^(1 ÷ 3,4) − 1 ≈ 96,8 %, soit un facteur de 1,968 par cycle. Avec ce facteur, un écart de 2 cycles correspond à un rapport de quantités de 1,968² ≈ 3,87, contre 4 si l’on supposait 100 %.
Repères
| Pente | Efficacité |
|---|---|
| −3,10 | 110 % |
| −3,32 | 100 % |
| −3,45 | 95 % |
| −3,58 | 90 % |
- Une efficacité entre 90 et 110 % est généralement acceptée (recommandations MIQE).
- Le R² de la droite doit dépasser 0,98 environ, sur au moins cinq points.
- Une efficacité supérieure à 110 % évoque souvent des inhibiteurs dans les points les plus concentrés, des dimères d’amorces ou une erreur de dilution.
ΔCt et ΔΔCt
La méthode 2^−ΔΔCt suppose que la cible et le gène de référence ont tous deux une efficacité proche de 100 %. Si ce n’est pas le cas, la méthode de Pfaffl utilise les facteurs réels de chaque couple d’amorces. Le calculateur montre côte à côte le rapport avec l’efficacité mesurée et le rapport théorique 2^ΔCt, pour visualiser l’erreur introduite.
Bonnes pratiques
- Réalisez chaque point en triplicat et excluez les points hors de la zone linéaire.
- Utilisez la même matrice que vos échantillons pour la gamme, afin de détecter les inhibitions.
- Vérifiez la courbe de fusion pour exclure les produits non spécifiques.