Du nanogramme au nombre de copies
Pour préparer une gamme étalon de qPCR, calibrer une PCR digitale ou doser un plasmide, il faut convertir une masse d’acide nucléique en nombre de molécules. Le calcul repose sur la masse molaire moyenne d’une paire de bases et sur le nombre d’Avogadro.
La formule
Copies = masse (g) × 6,022 × 10²³ ÷ (longueur × masse par base)
Les masses moyennes utilisées sont :
- 650 g/mol par paire de bases pour l’ADN double brin ;
- 330 g/mol par nucléotide pour l’ADN simple brin ;
- 340 g/mol par nucléotide pour l’ARN simple brin.
Exemple
10 ng d’un plasmide de 5 000 pb :
10 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (5 000 × 650) ≈ 1,85 × 10⁹ copies.
Dans 10 µL, cela fait 1,85 × 10⁸ copies par µL. Pour une solution mère à 10⁶ copies par µL, il faut diluer environ 185 fois, par exemple en deux étapes de 1/10 puis 1/18,5.
Le calculateur indique aussi la masse d’une seule copie (ici environ 5,4 × 10⁻¹⁸ g, soit 5,4 attogrammes) et la quantité de matière en femtomoles, utile pour les ligatures et le clonage.
Repères utiles
- Un génome humain haploïde (environ 3,1 × 10⁹ pb) pèse environ 3,3 pg : 1 ng d’ADN génomique humain contient donc près de 300 copies d’un gène à copie unique.
- Pour un plasmide, la longueur à saisir est celle du plasmide entier, insert compris.
- Pour un produit PCR, utilisez la taille de l’amplicon.
Précautions
- La masse est souvent mesurée au spectrophotomètre (A260), qui surestime la concentration en présence d’ARN, de nucléotides libres ou de contaminants. Une mesure fluorimétrique est plus fiable pour les faibles quantités.
- Préparez les dilutions extrêmes dans un tampon contenant un ADN porteur ou une faible concentration de détergent, pour limiter l’adsorption sur le plastique.
- Les copies très diluées suivent une loi de Poisson : en dessous d’une dizaine de copies par réaction, la variabilité devient importante.